Контактная информация|Архив журнала|Организации потребителей|карта сайта|rss|сделать стартовой
 
 

test.org.ua

Центр Экспертиз ТЕСТ

Помогаем делать правильный выбор!

Украина, Киев / понедельник / 18.06.18
Тесты и исследованияПолезно знатьО молоке начистотуЗнак КачестваОплата
Все тесты: А-Я
Разделы
Питание
Детское
Здоровье / Косметика
Авто / Вело
Электротехника
Стройка
Промтовары
Услуги
Определение содержания катехинов в чаях и соках методом ВЭЖХ (Карбовская Р.В., Копистенская Г.С., Забава Л.К., укр. язык).Determination of catechins 

заполняется...
заполняется...


УДК 612.393:577.151.6

 Визначення вмісту катехінів у чаях та соках методом ВЕРХ
Determination of catechins in teas and juices

Карбовська Р.В., Копистенська Г.С., Забава Л.К.
ТОВ "Сандора"

Розроблений метод кількісного визначення катехінів методом високоефективної рідинної хроматографії з використанням діодно-матричного детектора. Визначали вміст катехінів за часом утримування сигналів та характером спектрів в УФ-області. Проаналізовано вміст катехінів у чаях та соках. Показано, що після переробки фруктово-ягідної сировини вміст катехінів у ній залишається достатньо значним, що дає можливість розцінювати соки як альтернативу кофеїнвмісних чайних напоїв. Наведено хроматограми зеленого, чорного та липового чаїв, фрутових та ягідних соків.

The Determination of Catechins in теа and juices by HPLC
Karbovska R., Kopystenska H., Zabava L.
"Sandora" LLC

The method of qualitative determination of catechins by HPLC has been developed with using a diode-array detector. The determination was accomplished by the time of retention of catechins signals in the UV area. The concentration of catechins in teas and juices was analyzed. It is shown that, after processing, fruit and berry raw content of catechins in it is quite large, which makes it possible to regard juices as alternative caffeine containing tea drinks. Cromatograms of green, black and lime tea, fruit and berry juices are shown.

Определение содержания катехинов в чаях и соках методом ВЭЖХ
Карбовская Р.В., Копистенская Г.С., Забава Л.К.
ООО "Сандора"

Разработан метод количественного определения катехинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием диодно-матричного детектора. Определяли содержание катехинов по времени удерживания сигналов в УФ-области. Проанализировано содержание катехинов в чаях и соках. Показано, что после переработки фруктово-ягодного сырья содержание катехинов в нем остается достаточно значительным, что дает возможность расценивать соки как альтернативу кофеинсодержащих чайных напитков. Приведены хроматограммы зеленого, черного и липового чая, фруктовых и ягодных соков.

 
ВСТУП
Природні харчові продукти є джерелом основних життєдайних компонентів для організму людини. Із розвитком науки, зокрема хімії, поступово починають досліджувати природні продукти, вивчати їх склад, відтворювати чи замінювати окремі компоненти у інших продуктах. Так, аналізуючи та вивчаючи напої, насамперед чаї (чорні, зелені, білі, трав’яні, плодово-ягідні, тощо), відкрили такі корисні компоненти чаю як катехіни, що виконують багато біологічних функцій, включно з протизапальною, антиоксидантною та антиканцерогенною дією на організм. Для перших досліджень чаю на вміст катехінів використовували тонкошарову хроматографію, а з розвитком інструментальних методів – високоефективну рідинну хроматографію. Результати досліджень показують, що у чаї, окрім значної кількості катехінів, міститься також кофеїн, теобромін та інші речовини, що збуджують роботу нервової та серцево-судинної систем, призводять до підвищення рівня холестерину в крові та можуть викликати аритмію. Натомість дуже мало відомо про дослідження вмісту катехінів у фруктових соках і фруктових безалкогольних напоях, які не мають у своєму складі кофеїну.

Метою нашої роботи є розробити методику визначення вмісту основних катехінів у класичних й травяних чаях та фруктових напоях.

Структура та характеристика катехінів
Катехіни – природні сполуки, загальна назва яких походить від індійської акації катеху, в деревині якої ці речовини були вперше виявлені у 1821 році німецьким біохіміком Ф. Рунґе.

Катехіни – це капіляроукріплюючі флавоноїди, які нормалізують роботу серця та нирок.

Катехіни належать до сполук фенольного типу, поширених особливо у рослинах. Будову молекули катехінів встановили науковці Гейдельберґського університету (Німеччина) К. Фройденберґ, Г. Фікенчер, М. Хардер і О. Шмідт у 1925 році [1].

Катехіни за хімічною будовою поділяються на прості і складні та мають такий вигляд (рис. 1) [2]:




Рис. 1. Будова катехінів.


До простих належать: катехін, епікатехін, галокатехін і епігалокатехін, а до складних: епікатехінгалат, галокатехінгалат, епігалокатехінгалат. Складні катехіни є галовими естерами катехінів, тому їх ще часто називають галованими катехінами або катехінгалатами [3]. На рис. 2 показано утворення епікатехінгалату внаслідок реакції взаємодії епікатехіну з галовою кислотою.



Рис. 2. Схема приєднання залишків галової кислоти
(під дією ферментів) до молекул простих епікатехіну.


Радянський вчений М.Н. Запрометов дослідив, що процес галування катехінів відбувається послідовно: спочатку утворюються прості катехіни, кількість яких зростає, і вони починають взаємодіяти з галовою кислотою, що одночасно утворюється внаслідок біосинтезу [4]. Варто зазначити, що під дією ферменту танази галовані катехіни мають здатність до зворотнього відщеплення від своїх молекул залишків галової кислоти і перетворення на прості катехіни
Комплекс катехінів у чайних рослинах тривалий час називали комплексом дубильних речовин (чайний танін). У другій половин ХІХ ст. німецький вчений Г. Хлазевітц виділив з листків чаю дві фенольні сполуки. В 20-30-х роках ХХ ст. японська дослідниця М. Цуджимура отримала із зеленого чаю 3 кристалічних катехіни. В 40-х роках англійські біохіміки А. Бредфілд і А. Бейт-Сміт виділили вже 7 різних катехінів. Ці вчені вперше довели, що комплекс дубильних речовин у чайних листках – це і є комплекс катехінів [5]. Повністю розшифрували склад катехінів радянські вчені А.Л. Курсанов і М.Н. Запрометов [6]. Хімічну структуру катехінів, виділених із чаю, зображено на рис. 3, а основні властивості подано у табл. 1.1 [7].
Катехіни мають багато біологічних функцій, включаючи протизапальний, антиоксидантний та антиканцерогенний вплив, який індукує придушення запальних факторів, наприклад, при альтернативному лікуванні міокардиту. Пацієнти з важкою формою міокардиту страждають від прогресуючої серцевої недостатності, шоку або аритмії. Доведено, що катехіни пригнічують розвиток експресії кількох факторів запалення і в перспективі можуть бути використані в препаратах для запобігання міокардиту й інших серцево-судинних захворювань [8].


 
Рис. 3. Структура катехінів: (+)-катехін (С); (-)-епікатехін (ЕС); (-)-галокатехін (GC); (-)- епігалокатехін (EGC); (-)-катехінгалат (CG); (-)-епікатехінгалат (ECG); (-)-галокатехінгалат (GCG); (-)-епігалокатехінгатал (EGCG).


 
Експериментальна частина
Підготовка проби зразка
Процес підготовки зразка складається з кількох стадій:
•    розведення соків деіонізованою водою (або заварювання у випадку чаїв);
•    фільтрування через мембранний фільтр на основі ацетату целюлози (за необхідності);
Оскільки соки мають досить густу матрицю, їх для аналізу попередньо розводили: за допомогою піпеток класу А відібрали 2 см3 соку та 10 см3 води помістили в хімічну склянку і ретельно перемішали. Після розведення (якщо необхідне) мірним циліндром відібрали 10 см3 проби та відфільтрували за допомогою шприцевої насадки через ацетат целюлозний мембранний фільтр з розміром пор 0,45 μм.

Приготування елюентів для хроматографування
Мобільна фаза А: Трифлуороцтова кислота (TFA) (0,1%) у ацетонітрилі (5%)
У мірну колбу об’ємом 2000 см3 поміщають 1700 см3 підготовленої деіонізованої води і додають при перемішуванні 100 см3 ацетонітрилу кваліфікації HPLC, gradient grade (Sigma-Aldrich кат. № 34851).
Далі додають 2 см3 трифтороцтової кислоти (TFA, Sigma-Aldrich кат. № Т 6508), з масовою часткою основної речовини 99 % і доводять водою до мітки, ретельно перемішуючи.

Мобільна фаза Б: Трифлуороцтова кислота (0,1%) у ацетонітрилі
У мірну колбу об’ємом 1000 см3 поміщають 900 см3ацетонітрилу, додають 1 см3 TFA, доводять ацетонітрилом до мітки і ретельно перемішують.
Підготовлені розчини трифлуороцтової кислоти переносять у ємність для елюювання з темного скла (елюент А та елюент Б).

Умови проведення аналізу визначення катехінів:
•    Колонка – Discovery C18, 25×4,6, 5 мкм
•    Мобільна фаза: А – Трифлуороцтова кислота (0,1%),  ацетонітрил (5%) в воді.
•    Мобільна фаза: Б  – Трифлуороцтова кислота (0,1%) в ацетонітрилі.
•    Ґрадієнтний режим подачі елюєнтів.



•    Тривалість аналізу – 40 хв.
•    Температура термостатування колонки – 25 оС.
•    Об’ємна витрата елюєнта: 0,5 мл/хв.
•    Об’єм введення: 10 µл.
•    Детектор: УФ-DAD: A – 280 нм.

Обговорення результатів

Використовуючи діодно-матричний детектор, записували характерний спектр в УФ-діапазоні. У літературі зустрічались декілька довжин хвиль для визначення катехінів (230 нм, 255 нм, 280 нм). Результати вимірювань, наведені на рис. 4 свідчать про те, що в даних умовах для ідентифікації катехінів, щоб зменшити вплив матриці зразку, доречно використовувати довжину хвилі 280 нм. [9].. То ж, реєстрували досліджувані компоненти в зразках на найбільш селективній довжині хвилі 280 нм, а також стандартні розчини катехінів. Катехіни ідентифікували за часом утримування та за характером спектрів поглинання ( Рис.4). Спочатку записували хроматограми стандартного розчину кожного представника групи катехінів окремо для визначення часу утримування даної сполуки та вигляд кривої спектру поглинання у всьому УФ –діапазоні. Одержану інформацію використали для створення файлів бібліотеки методу, необхідної для ідентифікації катехінів у досліджуваних зразках.



Рис. 4. УФ-спектри основних катехінів: 1 – С, 2 – ЕС, 3 – GC, 4 – EGC, 5- ECG


Далі готували суміш стандартних розчинів катехінів і перевіряли можливість їхнього розділення за допомогою ВЕРХ. На рис. 5 показано типову хроматограму зразка суміші стандартних розчинів катехінів. Згодом прописували хроматограми водних витяжок зразків зеленого, чорного та липового чаїв, а також зразків фруктової сировини.
Аналіз фруктових соків і нектарів не належить до категорії вищого ступеня складності щодо пробопідготовки зразків, але ускладнюється розділенням та ідентифікацією компонентів з одного боку внаслідок значної кількості інших природніх сполук, наприклад, органічних кислот у їх складі, які сильно впливають на час утримування катехінів, а з другого – внаслідок різної кількості самих катехінів та їх похідних. Користуючись можливістю порівнювати спектри сигналів на хроматограмі та данними створеної бібліотеки для анлізованих сполук, можна з великою достовірністю визначати вміст катехінів.



Рис.5. Хроматограма суміші галової кислоти та катехінів:
 1 – галова кислота (GA); 2 – галокатехін (GC); 3 – епігалокатехін (EGC); 4 – катехін (C); 5 – епікатехін (EC); 6 – епігалокатехінгалат (EGC).


Серед усіх харчових продуктів найбільше катехінів міститься у чаях. Враховуючи їхній позитивний вплив на організм людини, а також превентивне застосування їх для запобігання серцево-судинним захворюванням і навіть атеросклерозу у промисловості почали випускати чаї з подвійним вмістом катехіну порівняно зі звичайним чаєм.
Порівняно із сумішшю стандартних розчинів катехінів найбільший вміст їх зафіксовано у зеленому чаї з подвійним вмістом катехінів торгової марки “Lipton Finea”, хроматограму якого наведено на рис. 6.



Рис. 6. Хроматограма зеленого чаю з подвійним вмістом катехінів торгової марки “Lipton Finea”: 1 - галова кислота (GA); 2 – галокатехін (GC);
3 – епігалокатехін (EGC); 4 – катехін (C); 5 – епікатехін (EC); 6 – кофеїн; 7 – катехінгалат (CG); 8 – епікатехінгалат (ECG).


Оскільки цей напій містить найбільшу кількість катехінів, то його зручно використовувати для порівняння з іншими напоями. Варто зазначити, що катехіни з часом здатні випадати в осад, що підтверджується зменшенням вмісту катехінів у відфільтрованому чаї порівняно з не фільтрованим. Для подальших досліджень чаю використовувались не фільтровані водні розчини.



Рис. 7. Хроматограма зеленого чаю торгової марки “Greenfield”:
 1 - галова кислота (GA), 2 – галокатехін (GC), 3 – катехін (С), 4 – кофеїн, 5 – катехінгалат (CG), 6 – епікатехінгалат (ECG).




Рис. 8. Хроматограма чорного чаю торгової марки “Greenfield”:
 1 - галова кислота (GA), 2 – галокатехін (GC), 3 – катехін (С), 4 – кофеїн, 5 – катехінгалат (CG), 6 – епікатехінгалат (ECG).




Рис. 9. Порівняльний вміст катехінів у чаях.


На рис. 9. показано вміст катехінів саме у чаях. Катехіни у чаї з часом випадають в осад, тому досліджували фільтрований і не фільтрований розчини чаю. При фільтруванні (зразок 2) вміст катехінів у чаї з подвійним їхнім вмістом дещо знижується. Вміст катехінів у чорному чаї (зразок 5) значно менший, ніж у зеленому (зразок 4). У методиках, описаних у літературі, проби для хроматографічного аналізу готували як у водних розчинах, так і спиртових, зокрема в метанолі. Аналогічно було розчинено чай у гарячій воді і в метанолі. Проби чаю хоч і з подвійним вмістом катехінів, приготовані у розчині метанолу (зразок 3) містять вдвічі меншу кількість катехінів, ніж у водному розчині. Отже, метанол як розчинник не надається для підготовки проб. Тому для дослідження були використані водні розчини зразків.



Рис. 10. Хроматограма натурального липового чаю: 1 - галова кислота (GA), 2 – галокатехін (GC), 3 – катехін (С), 4 – епікатехін (EC), 5 – катехінгалат (CG), 6 – епікатехінгалат (ECG).

 


Рис. 11. Порівняльний вміст катехінів у чаях.


Для побудови графіку, зображеного на рис. 11. використали результати досліджень вмісту катехінів у чорному, зеленому та липовому чаях. Липовий чай має більший вміст катехінів, порівняно з чорним, але менший, порівняно із зеленим, окрім того, варто відзначити, що на хроматограмі липового чаю (як і на хроматограмах фруктових соків), на відміну від чорного і зеленого чаю, немає кофеїну. А при вживанні кофеїну можуть розвинутися безсоння, неспокій, нудота, блювання, прискорене серцебиття, порушення ритму серця, грудний біль [10]. Відомо, що вживання кофеїну може пришвидшувати процеси, які відбуваються в організмі, що часто є необхідним, але доведено, що часте вживання кофеїну викликає звикання і залежність, і якщо в малих кількостях від стимулює роботу деяких систем організму, то у великих – навпаки, пригнічує.



Рис. 12. Хроматограма 100% натурального яблучного соку (освітленого)
1 – галокатехін (GC), 2 – епігалокатехін (EGC); , 3 – катехін (С), 4 – епікатехін (ЕС), 5 – катехінгалат (CG), 6 – епікатехінгалат (ECG), 7 – епігалокатехінгатал (EGCG)



Рис. 13. Хроматограма 100% натурального персикового соку: 1 – галова кислота (GA),  2 – галокатехін (GC), 3 – епігалокатехін (EGC), 4 – катехін (C), 5 – епікатехін (EC), 6 – катехінгалат (CG), 7 – похідні епікатехінгалату (ECG).


Рис. 14. Хроматограма 100% натурального грушевого соку:1 – галова кислота (GA),  2 – галокатехін (GC), 3 – епігалокатехін (EGC), 4 – катехін (C), 5 – епікатехін (EC), 6 – катехінгалат (CG), 7 – епікатехінгалат (ECG).


Рис. 15. Хроматограма 100% натурального соку чорної смородини:
1 – галова кислота (GA), 2 – галокатехін (GC), 3 – епігалокатехін (EGC), 4 – катехін (C), 5 – епікатехін (EC), 6 – катехінгалат (CG), 7 –епікатехінгалат (ECG).



Рис. 16. Хроматограма 100% натурального вишневого соку:
1 – галокатехін (GC), 2 – епігалокатехін (EGC); , 3 – катехін (С), 4 – епікатехін (ЕС), 5 – катехінгалат (CG), 6 – епікатехінгалат (ECG), 7 – епігалокатехінгатал (EGCG)



Рис. 17. Хроматограма 100% натурального гранатового соку: 1 – галова кислота (GA),  2 – галокатехін (GC), 3 – епігалокатехін (EGC), 4 – катехін (C), 5 – епікатехін (EC), 6 – катехінгалат (CG), 7 – епікатехінгалат (ECG).



Рис. 18. Хроматограма 100% натурального абрикосового соку:
1 – галова кислота(GA), 2 – галокатехін (GC), 3 – епігалокатехін (EGC), 4 – катехін (C), 5 – епікатехін (EC), 6 – катехінгалат (CG), 7 –епікатехінгалат (ECG).

 




Рис.19 Хроматограма 100% натурального малинового соку:
1 – галокатехін (GC), 2 – епігалокатехін (EGC), 3 – катехін (C), 4 – епікатехін (EC), 5 – катехінгалат (CG), 7 – епікатехінгалат (ECG).


Серед фруктових соків найбільший вміст катехінів та їх похідних має сік чорної смородини (на рівні вмісту катехінів у чорному чаї). Така кількість різних катехіновмісних сполук не дає змоги ефективно розділити сигнали на хроматографічній колонці, які утворюють суцільну зону (рис. 15). Існує думка, що саме завдяки великому вмісту катехінів вітамін С в продуктах із чорної смородини не так швидко руйнується й залишається довший час. У інших соках їх кількість зменшується. Такий популярний в Україні сік, як яблучний за вмістом катехінів поступається гранатовому, вишневому та персиковому. В роботі використали дані вмісту катехінів для фільтрованого й освітленого яблучного соку. У зразках не фільтрованого соку прямого віджиму вміст катехінових сполук значно вищий. Це обумовлено тим, що похідні катехінів маючи вище описані структурні формули добре розчинні тільки в гарячому зразку, а при охолодженні випадають в осад, утворюючи щільний наліт, від якого намагаються звільнити продукт шляхом фільтрування задля привабливості товарного виду. Це призводить до зменшення вмісту цінних антиоксидантних катехінових сполук й відповідно харчової цінності фруктового напою.
Таким чином, вживання фруктових напоїв у вигляді соків та нектарів може скласти альтернативний варіант для усіх категорій населення традиційним катехіновмісним напоям. При цьому варто зазначити, що порівняно із чаями та іншими безалкогольними напоями типу Cola, окрім відсутності кофеїну у фруктових соках містяться й ряд інших поживних речовин, таких як органічні та гідроксикоричні кислоти, флаваноїди. Адже, саме за наявність в фруктових напоях природних поліфенольних сполук і вітамінів, що разом із катехінами створюють синерґетичний ефект у відношенні антиоксидантних властивостей, робить їх унікальними поживними продуктами. Саме по цій причині фруктовим сокам слід надати перевагу й використовувати їх як профілактику захворювань серцево-судинної системи, які на сьогодні є найпоширенішою причиною смертності в усьому світі.



Рис. 20 Вміст катехінів у фруктових соках.


Застосований в даній роботі метод ВЕРХ, відповідає вимогам міжнародних стандартів і дозволяє ефективно розділити катехіни. Використаний метод дозволяє ідентифікувати аналізовані компоненти не тільки за часом утримання, а також за характером поглинання в усьому УФ-діапазоні. Точність визначення підвищується завдяки можливості паралельно записувати спектри не тільки на вибраній аналітичній довжині хвилі, але й на інших хвилях, характерних для даної сполуки, а також порівнювати відповідність спектрів аналізованих речовин з бібліотекою спектрів, записаною у програмному забезпеченні. Порівняння спектральних характеристик досліджуваних речовин зі створеною бібліотекою стандартних розчинів слугує додатковим джерелом підтвердження відповідності сигналу на хроматограмах конкретним речовинам, чого не може дати жодний метод, використовуваний раніше. Функція перевірки чистоти спектру для кожного сигналу дозволяє виключити можливість будь-яких накладок, тим самим значно збільшити точність кількісного аналізу. Це з успіхом використовується при виявленні невідповідності кількісного, а іноді навіть якісного складу продукту.



ВИСНОВКИ
 •    Катехіни – природні флавоноїди, що володіють антиоксидантними властивостями, допомагають при порушеннях серцево-судинної системи, виявляють протизапальну, гіпотензивну та загальнозміцнюючу дію.
•    Розроблений метод кількісного визначення катехінового вмісту в чаях, фруктово-ягідній сировині та готових безалкогольних напоях.
•    Експериментально встановлені умови для визначення катехінів за допомогою діодно-матричного детектора та практично доведена ефективність ідентифікації при застосуванні бібліотеки спектрів.
•    Підтверджено наявність основних відомих катехінів та їх автентичність у чорному, зеленому та липовому чаях, а також у фруктово-ягідній соках. Вміст катехінів у чаях найбільший, але досить багато їх міститься також у фруктових соках, які на відміну від чаїв, не містять кофеїну.
•    Фруктові та ягідні соки, завдяки наявності природних біофлавоїдів, органічних кислот та вітамінів, являються більш корисними та поживними в порівнянні з іншими безалкогольними напоями у раціоні людини.
•    Хроматографічний метод кількісного визначення катехінів за допомогою можливостей діодно-матричного детектора є чутливим, селективним та надійним й дозволяє підтверджувати склад напоїв (чаїв, соків), робити висновок про натуральність та якість цих продуктів.
 


СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

  1. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов./М.Н.Запрометов – М.:Наука, 1964, 294 с.
  2. Бокучава М.А. Биохимия чая и чайного производства / М.А. Бокучава - АН СССР, 1958, 585 с.
  3. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentiation of green, black and instant teas. (Analyst) / P.L. Fernandez // 125.3 – 2000. С. 421-425.
  4. Цоциашвили И.И. Химия и технология чая / И. И Цоциашвили. М.А. Бокучава – М.: Агропромиздат, 1989, 391 с.
  5. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений: Учебное пособие / М.Н. Запрометов. – М.:Высшая школа, 1974, 275 с.
  6. Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallic acids in green, Oolong, black and pu-erh teas using HPLC with a photodiode array detector / Zuo, Yuegang, Hao Chen, and Yiwei Deng //Talanta 57.2 – 2002. С. 307-316.
  7. Бокучава М.А. Выделение кристалических катехинов из высококачественного черного чая / Н.И. Орагвелидзе, А.М. Князева. – 1966, 187 с.
  8. Гейсс Ф. Основи тонкошарової хроматографії (планарна хроматографія), в 2 томах. [Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatography) by F. Geiss]/ (пер. Кошевнік М. А., Лапін Б. П). - 1988.
  9. Comparative Evaluation of Differet Co-Antioxidants on the Photochemical- and Functional-Stability of Epigallocatechin-3-gallate in Topical Creams Exposed to Simulated Sunlight / S.Scalia, N.Marchetti, A.Bianchi // Moleculs 18, 2013, С. 574-587
  10. Інструкція для медичного застосування препарату Кофеїн-бензоат натрію – Дарниця [Електронний ресурс]. Режим доступу до інструкції http://mozdocs.kiev.ua/likiview.php?id=6067
Коллеги, друзья и партнеры
Copyright©НИЦНПЭ ТЕСТнаписать намперейти вверх
 
 
TopList www.webmoney.ru
Проверить аттестат